Analiza zmian molekularnych w komórkach i tkankach, z wykorzystaniem technik spektrometrii mas

Abstract

Rozprawa dotyczy zastosowania obrazowania za pomocą spektrometrii mas (MSI) do analizy wybranych związków biologicznie istotnych, takich jak glukoza, cholesterol, lipidy oraz peptydy powstające w wyniku trawienia tryptycznego. Celem badań była optymalizacja metod przygotowania próbek oraz warunków pomiarowych, a także wykorzystanie techniki MSI do analizy zmian molekularnych w różnych modelach biologicznych. Praca składa się z szeregu analiz różnych molekuł, opisując problematykę eksperymentów, przebieg oraz poszczególne dyskusje. We wprowadzeniu przedstawiono podstawy spektrometrii mas w obrazowaniu typu MALDI TOF oraz charakterystykę jej zastosowań w badaniach biomolekulamych. Część eksperymentalna obejmuje analizy glukozy i innych heksoz, cholesterolu oraz lipidów, ze szczególnym uwzględnieniem wpływu procedur przygotowania próbek na jakość i powtarzalność uzyskiwanych wyników. Stosując zoptymalizowaną metodę przeprowadzono również badania lipidomiczne nerek po podaniu morfiny, pozwalające na identyfikację zmian molekularnych zachodzących w tkance. Istotnym elementem pracy są analizy pojedynczych komórek, kocich oocytów, w których oceniano zależność pomiędzy zróżnicowaniem zabarwienia cytoplazmy, a profilem lipidowym komórek. Wykazano istnienie różnic w lipidomie oocytów typu „dark” i „hetero”, co wskazuje na potencjalne znaczenie tych obserwacji w badaniach biologii rozrodu. Przeprowadzono również badania optymalizacyjne dotyczące warunków wilgotności podczas trawienia tryptycznego - eksperymenty wykazały, że najlepsze warunki wilgotności podczas trawienia utrzymywały się przy wykorzystaniu roztworu KNO3. Analiza umożliwiła poprawę efektywności procesu i jakości uzyskiwanych widm. Uzyskane wyniki potwierdzają wysoką użyteczność technik spektrometrii mas i MSI w analizach biomolekulamych oraz podkreślają kluczową rolę odpowiedniego przygotowania próbek i kontroli warunków eksperymentalnych. Praca wnosi istotny wkład w rozwój metod analitycznych stosowanych w badaniach biologicznych i biomedycznych. The dissertation concerns the use of mass spectrometry imaging (MSI) for the analysis of selected biologically relevant compounds, such as glucose, cholesterol, lipids, and peptides produced as a result of tryptic digestion. The aim of the research was to optimize sample preparation methods and measurement conditions, as well as to use MSI to analyze molecular changes in various biological models. The thesis consists of a series of analyses of various molecules, describing the issues involved in the experiments, their course, and individual discussions. The introduction presents the basics of mass spectrometry in MALDI TOF imaging and the characteristics of its applications in biomolecular research. The experimental part includes analyses of glucose and other hexoses, cholesterol, and lipids, with particular emphasis on the impact of sample preparation procedures on the quality and repeatability of obtained results. Using an optimized method, lipidomic studies of the kidneys after morphine administration were also conducted, allowing for the identification of molecular changes occurring in the tissue. An important element of the work is single cat oocytes analysis in which the relationship between I cytoplasmic color variation and the cellular lipid profile was assessed. Differences in the lipidome between “dark” and “hetero” oocytes were demonstrated, indicating the potential significance of these observations in reproductive biology research. Optimization studies were also conducted on humidity conditions during tryptic digestion. The experiments showed that the best humidity conditions during digestion were maintained when using a KNO3 solution. This optimization improved process efficiency and enhanced the quality of the obtained spectra. The results confirm the high utility of mass spectrometry and MSI techniques in biomolecular analyses and emphasize the crucial role of proper sample preparation and control of experimental conditions. The work makes a significant contribution to the development of analytical methods used in biological and biomedical research.