Badania in-vitro wpływu mutacji cichych na oligomeryzację receptorów błonowych z zastosowaniem technik fluorescencyjnych

Abstract

Some polymorphisms of dopamine receptors have been postulated to correlate with schizophrenia phenotype or to change individual response to the antipsychotic treatment. Silent mutations have been known to be functionally neutral, however more and more papers have proved that such mutations may alter protein functions. Two silent polymorphisms within the coding region of the dopamine $D_{1}$ receptor ($D_{1}R^{G198A}$ and $D_{1}R^{G126A}$) which have been indicated to correlate with schizophrenia have been studied in the presented thesis. In order to determine whether the investigated synonymous polymorphisms influence the heterodimerization of dopamine $D_{1}-D_{2}$ receptors the following approaches have been employed: molecular biology methods (site-directed mutagenesis, construction of fusion proteins and their expression in eukaryotic cell system) and biochemical analysis of a receptor-ligand binding, as well as advanced biophysical approaches (fluorescence lifetime measurements to determine fluorescence resonance energy transfer (FRET) efficiency, analysis of the cellular localization of the receptor proteins with use of a laser confocal microscopy). The altered hetero-dimerization that likely results from the lower expression of these genetic variants of $D_{1}R$ with $D_{2}R$, while not affecting the cellular localization of the receptor proteins may be partially responsible for the association of both G198A and G1263A polymorphisms with the schizophrenia phenotype. Uważa się, że polimorfizmy w obrębie genów receptorów dopaminowych mogą wpływać na podatność na schizofrenię lub zmieniać indywidualną odpowiedź pacjenta na terapię. Dotychczas mutacje ciche uznawano za funkcjonalnie neutralne, aczkolwiek coraz liczniejsze doniesienia literaturowe pokazują, że mogą one wpływać na zmianę funkcji powstającego białka. W niniejszej pracy zbadano dwa ciche polimorfizmy w obrębie sekwencji kodującej receptora dopaminowego $D_{1} (D_{1}R^{G198A}$ i $D_{1}R^{G126A}$), wybrane z uwagi na ich postulowany udział w etiopatogenezie schizofrenii. W celu określenia wpływu tych mutacji na heterodimeryzację receptorów dopaminowych $D_{1}-D_{2}$ wykorzystano nowoczesne techniki z zakresu biologii molekularnej (ukierunkowana mutageneza, konstrukcja białek fuzyjnych i ich ekspresja w modelowych komórkach eukariotycznych) i biochemii (analiza wiązania receptor-ligand) oraz zaawansowane metody biofizyczne (pomiar czasów życia fluorescencji do wyznaczenia wydajności fluorescencyjnego rezonansowego przeniesienia energii FRET i analiza lokalizacji białek receptorowych w komórce z wykorzystaniem laserowej mikroskopii konfokalnej). Na podstawie przeprowadzonych doświadczeń stwierdzono, że zaniżona heterodimeryzacja, która może wynikać z obniżonej ekspresji badanych wariantów genetycznych receptora $D_{1}$ bez równoczesnej zmiany lokalizacji białka receptorowego w komórce, może częściowo tłumaczyć korelację obu cichych polimorfizmów z występowaniem schizofrenii.